13 Juil Effets secondaires de CRISPR : une solution trouvée

Article publié récemment par l’équipe 08 – Biotherapies Génétique et Oncologie (BioGO) dans Nature communications

Auteurs : Cullot G*, Boutin J*, Fayet S*, Prat F*, Rosier J, Cappellen D, Lamrissi I, Pennamen P, Bouron J, Amintas S, Thibault C, Moranvillier I, Laharanne E, Merlio JP, Guyonnet-Duperat V, Blouin JM, Richard E, Dabernat S, Moreau-Gaudry F*, Bedel A* (*Contributed equally).

Le système CRISPR-Cas9 est issu de l’immunité bactérienne. Il a été détourné pour modifier le génome. Cette découverte a permis à Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier d’obtenir le prix Nobel de Chimie en 2020. De part son efficacité et sa simplicité de mise en œuvre, il a révolutionné notre capacité à modifier avec précision le génome et a conduit à l’édition de gènes dans des applications cliniques. En ciblant le génome via un guide ARN, il permet la réalisation d’une coupure double brin précise dans l’ADN, à un locus donné. Cette coupure permet l’invalidation ou la correction du gène ciblé.

Malheureusement, des effets secondaires, appelés génotoxicité, ont rapidement été décrits. Des coupures hors cibles peuvent induire des modifications sur des gènes non ciblés initialement ou de grands remaniements tels que des translocations chromosomiques (génotoxicité « OFF-target »). Heureusement, ce type de génotoxicité est désormais sous contrôle grâce au développement d’outils CRISPR-Cas9 dits de « haute-fidélité ». Plus récemment, une autre forme de génotoxicité a été décrite. La coupure double-brin au niveau du gène ciblé peut aboutir à un large éventail de modifications génomiques, pas toujours souhaitées ni anticipées, dues à la complexité des mécanismes de réparation des cassures double-brin d’ADN (génotoxicité « ON-target »).

La génotoxicité « ON-target » a longtemps été sous-estimée. En effet, elle peut induire des grandes anomalies de plusieurs milliers de bases à plusieurs millions de bases qui ne sont pas détectables par les méthodes standard basées sur la PCR. Notre laboratoire, en utilisant des méthodes génomiques (FISH, single cell CGH-array/SNP-array) a permis de mettre en évidence de grands remaniements chromosomiques dans 0,1 à 10% des cellules [1] :

1. perte de l’extrémité chromosomique, appelée CL-LOH pour loss-of heterozygosity with copy-loss, ou
2. modification de l’extrémité chromosomique à l’identique de l’autre allèle, tel un « copier-coller ». Ces dernières sont appelées CN-LOH pour copy-neutral loss-of heterozygosity.

Nous avons montré que ces anomalies sont induites par la cassure double-brin, indépendamment du site de coupure et dans plusieurs types cellulaires [2,3]. Elles peuvent par exemple être mises en évidence dans les cellules souches hématopoïétiques, cellules d’intérêt pour la thérapie génique des maladies génétiques hématologiques, en ciblant les gènes de globines [3].

Ces grandes anomalies peuvent par exemple aboutir à une mutation homozygote affectant un gène suppresseur de tumeur, auparavant hétérozygote. De façon inattendue, ces modifications peuvent aussi induire des modifications épigénétiques. Nous avons mis en évidence des anomalies de méthylations de gènes à empreintes parentales en amont de la coupure au locus 11p15, induisant des modifications transcriptionnelles [3].

Ces évènements qui restent heureusement rares sont très difficiles à mettre en évidence. Nous avons développé deux systèmes sensibles de détection basés sur la cytométrie. Ces deux systèmes, appelés FAMReD, permettent la détection, la quantification et le tri cellulaire des cellules éditées qui ont un remaniement chromosomique. Ces outils nous ont permis de montrer que la fréquence de ces évènements dépend de p53, et de la prolifération. Les cellules déficientes en p53 ou qui prolifèrent au moment de l’édition par CRISPR ont une plus grande susceptibilité d’avoir de la génotoxicité ON-target. À l’inverse, les cellules quiescentes semblent protégées. Nous avons montré que le palbociclib, un inhibiteur de cdk4/6, qui bloque temporairement les cellules en phase G1 avant l’édition par CRISPR, permet de réduire considérablement ces évènements non souhaités. Ces résultats viennent d’être publiés dans Nature communications [4]. Un brevet en ce sens a été déposé avec INSERM Transfert.

CRISPR est déjà employé dans les essais cliniques. Ces résultats montrent qu’il serait souhaitable d’adapter les protocoles d’édition génique utilisant la coupure double-brin pour une utilisation plus sûre en clinique.

Financements : ANR, AFM Téléthon, Ligue contre cancer

Collaborations : CHU Bordeaux, TBM Core, INSERM Transfert

[1] ON-Target Adverse Events of CRISPR-Cas9 Nuclease: More Chaotic than Expected. Boutin J, Cappellen D, Rosier J, Amintas S, Dabernat S, Bedel A, Moreau-Gaudry F. CRISPR J. 2022 Feb;5(1):19-30. doi: 10.1089/crispr.2021.0120. PMID: 35099280/

[2] CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations. Cullot G*, Boutin J*, Toutain J, Prat F, Pennamen P, Rooryck C, Teichmann M, Rousseau E, Lamrissi-Garcia I, Guyonnet-Duperat V, Bibeyran A, Lalanne M, Prouzet-Mauléon V, Turcq B, Ged C, Blouin JM, Richard E, Dabernat S, Moreau-Gaudry F*, Bedel A*. Nat Commun. 2019 Mar 8;10(1):1136. doi: 10.1038/ s41467-019-09006-2. PMID: 30850590

[3] CRISPR-Cas9 globin editing can induce megabase-scale copy-neutral losses of heterozygosity in hematopoietic cells. Boutin J*, Rosier J*, Cappellen D, Prat F, Toutain J, Pennamen P, Bouron J, Rooryck C, Merlio JP, Lamrissi-Garcia I, Cullot G, Amintas S, Guyonnet-Duperat V, Ged C, Blouin JM, Richard E, Dabernat S, Moreau-Gaudry F*, Bedel A*. Nat Commun. 2021 Aug 13;12(1):4922. doi: 10.1038/s41467-021-25190-6. PMID: 34389729

[4] Cell cycle arrest and p53 prevent ON-target megabase-scale rearrangements induced by CRISPR-Cas9. Cullot G*, Boutin J*, Fayet S*, Prat F*, Rosier J, Cappellen D, Lamrissi I, Pennamen P, Bouron J, Amintas S, Thibault C, Moranvillier I, Laharanne E, Merlio JP, Guyonnet-Duperat V, Blouin JM, Richard E, Dabernat S, Moreau-Gaudry F*, Bedel A*. Nat Commun. 2023 Jul 10;14(1):4072. doi: 10.1038 /s41467-023-39632-w. PMID: 37429857